Como é feito o processo de identificação de paternidade pela comparação do DNA?

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Introdução

O exame de DNA, também chamado de teste de DNA ou, ainda, de mapeamento genético, é um procedimento laboratorial que compara amostras de material genético de indivíduos diferentes. A partir dessa análise, é possível determinar graus de semelhança entre as amostras coletadas e, dessa forma, pode ser utilizado para comprovar o parentesco, geralmente a paternidade, entre dois indivíduos.

O teste de paternidade é utilizado como prova do vínculo biológico entre indivíduos, principalmente em questões judiciais, como reivindicação de herança, direitos paternos, benefícios sociais, entre outras. Contudo, apenas apresenta validade jurídica se a coleta do material genético obedecer a padrões bem estabelecidos tanto de coleta, quanto de transporte e armazenamento da amostra.

O grau de confiabilidade do exame de DNA é bastante alto, estabelecendo uma certeza de 99,9% de que o resultado encontrado esteja correto. Outra aplicação do mapeamento genético é na medicina forense, para identificar suspeitos utilizando amostras de material genético encontradas em cenas de crimes.

Ácido Desoxirribonucleico (DNA)

O Ácido Desoxirribonucleico (DNA) é encontrado em todos os organismos existentes, podendo ser localizado no interior do núcleo dos eucariontes, ou no próprio citoplasma dos procariontes.

Estruturalmente, o DNA é constituído por duas longas cadeias polinucleotídicas formadas a partir de monômeros chamados nucleotídeos. Os nucleotídeos são formados através da ligação entre um íon fosfato, o açúcar desoxirribose e uma base nitrogenada que pode ser timina, guanina, adenina e citosina. As bases nitrogenadas se pareiam através de ligações de hidrogênio de forma altamente específica, a adenina se pareia com a timina e a guanina com a citosina, formando a estrutura tridimensional conhecida como DNA: uma escada em espiral ou uma dupla hélice.

Fórmula tridimensional do DNA. 

A estrutura do DNA é altamente conservada entre os organismos, inclusive com longos trechos idênticos. Essa conservação da molécula está relacionada à sua função, que é a de armazenar informações genéticas.

O DNA é como um manual contendo todas as características de um indivíduo. Essas características são determinadas através da sequência de bases nitrogenadas contidas em uma fita. Nos trechos de DNA, as informações contidas em trechos, chamados de genes, são reescritas na forma de RNA, através do processo de Transcrição. Após a síntese de RNA, o mesmo leva a informação aos ribossomos, para a síntese protéica pelo processo de tradução. 

Além de armazenar as informações genéticas, o DNA também é responsável por transmitir essa informação genética para os descendentes. Em reproduções sexuadas, os gametas (células reprodutoras) levam parte do código genético na forma de DNA, o qual, após a fecundação, forma o DNA completo do descendente, que passa a se desenvolver. Metade do DNA de um ser humano é de origem paterna, enquanto a outra metade é herdada da mãe. É devido a essa herança de trechos de DNA que é possível determinar a paternidade de indivíduos.

Dentro da molécula de DNA dos mamíferos, existem pequenas sequências chamadas de VNTR (Variable Number of Tandem Repeats: repetições de sequências de números variáveis) e cada pessoa tem um padrão específico de repetição dessas unidades, que é herdado dos pais. Portanto, um dos métodos de identificação do parentesco entre duas ou mais pessoas é analisar esse padrão repetitivo herdado através de sondas capazes de detectar essas sequências.

O uso das VNTR diminuiu o tempo de espera para o resultado do exame, já que diminuiu a quantidade de DNA para ser analisado. Atualmente, não é preciso analisar todo o genoma dos indivíduos que serão submetidos ao mapeamento genético, mas apenas as regiões VNTR.

Etapas do Exame de DNA

O processo experimental é chamado de DNA fingerprint. A primeira etapa do exame de DNA consiste na coleta das amostras de todos os indivíduos relacionados. No caso, de um exame de paternidade, é preciso coletar não só amostras de material genético do(s) suposto(s) pai(s) e do(s) filho(s), como também da mãe, já que metade do material genético do filho é herdado da mãe.

A amostra pode ser sangue, pêlos e fios de cabelo contendo raiz, pedaços de pele, esperma e todo e qualquer material que contenha células dos indivíduos. Atualmente o método mais utilizado é o esfregaço da mucosa bucal com uma haste flexível para coletar células da boca.

Uma vez coletadas as amostras, elas passam por processos de extração e purificação do DNA, a fim de que, ao final dos processos, apenas o DNA dos indivíduos possa ser submetido às demais etapas.

Após a purificação, o DNA de cada indivíduo é colocado, separadamente, em contato com enzimas de restrição muito utilizadas na Engenharia Genética. Essas enzimas possuem a capacidade de clivar (quebrar) a molécula de DNA ao encontrar sequências específicas de pares de base, formando, assim, um conjunto de moléculas de DNA separadas em vários pedaços de tamanhos variados.

É muito importante que seja usada a mesma classe de enzimas de restrição em cada amostra de DNA dos indivíduos. Como metade do material genético é herdado do pai e metade é herdado da mãe, espera-se que o padrão de fragmentos encontrado na amostra do(s) suposto(s) filho(s) seja similar aos fragmentos encontrados na amostra de DNA materno e do(s) suposto(s) pai(s).

Uma vez que o DNA de todos os indivíduos esteja fragmentado, as amostras são submetidas a um processo de separação chamado eletroforese. A eletroforese faz com que moléculas carregadas migrem de um pólo a outro dentro um gel de eletroforese quando submetidas a uma corrente elétrica. Ao longo dessa migração, ou "corrida eletroforética", as moléculas menores de DNA tendem a "correr" mais rapidamente para o polo oposto, enquanto as moléculas maiores, devido a dificuldade em se movimentarem com o pulso elétrico, acabam não correndo tão rapidamente

Equipamento de Eletroforese em Gel.

Ao final da corrida, as moléculas menores tendem a se localizar na região mais baixa do gel, enquanto as moléculas maiores tendem a se concentrar na região inicial da corrida, localizada na parte superior do gel. As concentrações dessas moléculas formam bandas ao longo do gel que, ao ser corado com corantes específicos e submetido à luz UV, pode ser analisado.

Exemplo de um gel de eletroforese corado. As bandas localizadas na parte superior do gel são fragmentos maiores de DNA e as bandas localizadas na região inferior do gel são de fragmentos menores de DNA. 

Interpretação do Exame de DNA

Sabendo que o padrão observado na coluna do DNA do(s) suposto(s) filho(s) deve ser encontrado do DNA materno e/ou na coluna do DNA do(s) suposto(s) pai(s), os cientistas analisam banda por banda do gel encontrado.

A banda que não for similar entre a mãe e o filho (a mãe possui uma banda e o filho não ou o filho possui uma banda e a mãe não) é, então, comparada entre o filho e o suposto pai. Se as bandas forem semelhantes, isto é, se os indivíduos possuírem o mesmo padrão (ausência ou presença de banda), significa que o DNA é complementar e, portanto, apresenta um grau de parentesco.

Exemplo de um gel de eletroforese para exame de paternidade. Nesse gel o filho recebeu um alelo marcado em verde da mãe e recebeu um alelo marcado em verde do pai. 

As faixas observadas são únicas para cada pessoa e são geradas a partir união do DNA materno presente no óvulo e do DNA paterno presente no espermatozóide no momento da fecundação, por isso, esse processo também é conhecido como impressão digital genética.

Alguns fatores podem interferir no resultado do teste de DNA: 

• Caso algum dos indivíduos já tenha feito transfusão de sangue, isso deve ser avisado no laboratório; 
• Erros na manipulação da amostra podem acusar falso-negativos (quando o resultado do teste é negativo, mas deveria ser positivo); 
• Outro motivo para falso-negativos é a incidência de mutação, mas é um fato muito raro de ocorrer; 
• Um resultado falso-positivo (quando o resultado deu positivo, mas não deveria) ocorre apenas por erros na interpretação ou uso de técnica inadequada, usando poucos marcadores genéticos.

No caso de gêmeos univitelinos, quando o DNA de ambos os irmãos é idêntico, o procedimento para conseguir diferenciar um DNA do outro é mais complexo e demorado. Praticamente todo o genoma precisa ser analisado de ambos os irmãos a fim de buscar mutações que possam ser semelhantes a da amostra comparada. Enquanto o processo de DNA fingerprint leva aproximadamente 24 horas para dar o resultado, no caso de gêmeos univitelinos, o processo pode demorar até 30 dias.

Referências

SILVERTHORN et. al. Fisiologia Humana. 7ª edição. ArtMed.

GUYTON & HALL. Tratado de Fisiologia Médica. 12ª edição. Elsevier.