Quais os tipos de perigos existentes em um laboratório de microbiologia?

As Boas Práticas de Laboratório (BPL) podem ser definidas como um sistema de qualidade relacionado com o processo de organização e as condições que o laboratório: planeja, executa, acompanha, registra, arquiva e apresenta os resultados dos seus ensaios (BRASIL, 2012). Os laboratórios apresentam agentes de riscos químicos, físicos e biológicos relacionados aos materiais e métodos empregados. Para que tenha a prevenção desses riscos, além das BPL, deve-se considerar a biossegurança para proteger o analista e para assegurar a precisão dos resultados das análises de alimentos.

A biossegurança é o grupo de condições de segurança alcançadas por um conjunto de ações destinadas a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar os fatores de risco inerentes às atividades que possam comprometer a saúde humana, animal e o meio ambiente (BRASIL, 2005). Segundo o documento “Classificação de Risco dos Agentes Biológicos” do Ministério da Saúde, os agentes biológicos podem ser classificados em:

• Classe de risco 1: contempla os agentes biológicos que não causam doença em indivíduos ou animais sadios. Como exemplo: Lactobacillus sp. e Bacillus suntilis.

• Classe de risco 2: contempla os agentes biológicos que provocam infecção nos indivíduos ou animais, mas o seu potencial de transmissão na comunidade e no meio ambiente é limitado, além de existirem medidas terapêuticas e preventivas eficazes. Como exemplo: Schistosoma mansoni e vírus da rubéola.

• Classe de risco 3: contempla os agentes biológicos transmitidos por via respiratória e causam doenças que podem levar à letalidade. Existem medidas de tratamento e/ou prevenção. Como exemplo: Bacillus anthracis e Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV).

• Classe de risco 4: contempla os agentes biológicos com grande transmissão por via respiratória ou de transmissão desconhecida. Causam doenças de alta gravidade, com alta transmissão na comunidade e meio ambiente. Como exemplo: vírus da Ebola.

Os critérios considerados para a classificação de risco dos agentes biológicos são:

• Virulência: referente à capacidade patogênica de um agente biológico, mensurada pela mortalidade que ele causa e/ou sua capacidade de invadir tecidos do hospedeiro. A sua avaliação pode ser realizada por meio de dois coeficientes: de letalidade e de gravidade, em que o primeiro indica o percentual de casos da doença que são mortais e o segundo o percentual dos casos graves.

• Modo de transmissão: seria o caminho realizado pelo agente biológico do local da exposição até o hospedeiro. O seu conhecimento é essencial para aplicação de ações para reprimir a transmissão do patógeno.

• Estabilidade: capacidade de manutenção do potencial infeccioso de um agente biológico no meio ambiente, tais como em condições adversas: exposição à luz, à radiação ultravioleta, às temperaturas, à umidade relativa e aos agentes químicos.

• Concentração e volume: representa a quantidade de agentes patogênicos por unidade de volume. Quanto maior a concentração, maior será o risco.

• Origem do agente biológico potencialmente patogênico: representa a origem do hospedeiro do agente biológico, podendo ser animal ou humano. Considera, também, a localização geográfica (áreas endêmicas) e a natureza do vetor: vírus, bactéria (gram positiva ou gram negativa), protozoário, entre outros.

• Disponibilidade de medidas profiláticas eficazes: são medidas preventivas por vacinação, antissoros e globulinas eficazes. Além do emprego de medidas sanitárias, controle de vetores e medidas de quarentena.

• Disponibilidade de tratamento eficaz: referente à disponibilidade de tratamento eficaz, que possibilita a contenção do agravamento e a cura da doença causada pela exposição ao agente patogênico. Contempla a imunização e vacinação pós-exposição, prescrição de antibióticos e medicamentos terapêuticos.

• Dose infectante: é o número mínimo de agentes patogênicos necessários para causar a doença. É variável conforme a virulência do agente e susceptibilidade do indivíduo.

• Manipulação do agente patogênico: pode aumentar o risco, como por ampliação ou centrifugação.

• Fatores referentes ao profissional: referente ao estado de saúde do profissional e a fatores individuais variáveis, como idade, sexo, fatores genéticos, susceptibilidade individual, estado imunológico, exposição prévia, consumo de medicamentos, hábitos de higiene pessoal e uso de equipamento individual – EPI (que será abordado mais adiante).

Cada classe de risco tem um nível de biossegurança correspondente com exigências de procedimentos-padrão, uso de equipamentos de contenção e instalações laboratoriais mais complexas. Além disso, os analistas devem ser capacitados para manipulação em contenção dos agentes biológicos.

• Nível de Biossegurança 1 (NB-1)

Nível básico de contenção e contempla a adoção das BPL. Recomendado para trabalho com agentes biológicos da classe de risco 1. Os equipamentos ou dispositivos de contenção especial, como cabines de segurança biológica (CSB) e autoclaves não são obrigatórias.

Procedimentos-padrão de laboratório:

• O acesso deve ser restrito aos analistas envolvidos nas atividades do laboratório;
• Os procedimentos técnicos ou administrativos devem ser descritos, documentados e com capacitação da equipe para executá-los;
• As áreas de circulação devem ter livre acesso e a porta deve ser identificada com símbolo internacional de risco biológico (Figura 1);
• A lavagem das mãos deve ser frequente, especialmente após a manipulação desses agentes e depois da finalização das atividades no laboratório;
• A pipetagem deve ser executada com equipamentos para esse fim e, jamais, com a boca;
• O armazenamento de alimentos no laboratório é proibido, exceto o que será analisado;
• Não é permitido comer, beber, fumar, aplicar perfumes;
• É proibido ao analista usar cosméticos e adornos: brincos, pulseiras, relógios;
• Os materiais e reagentes deverão ter um local destinado para armazenamento no laboratório;
• A limpeza e descontaminação da bancada deve ser realizada ao finalizar as análises ou quando tiver a contaminação com agentes biológicos;
• Os resíduos devem ser descartados conforme o Plano de Gerenciamento de Resíduos;
• Deve ter plano de contingência e emergência para caso de acidentes.

Equipamentos de contenção

• Equipamentos de Proteção Individual (EPI): jaleco de manga longa e de uso restrito ao ambiente do laboratório, luvas, óculos, máscara, sapatos fechados. O laboratório deve ter dispositivo de emergência para os olhos e chuveiros de emergência.

• Nível de Biossegurança 2 (NB-2)

Recomendado para trabalho com agentes biológicos da classe de risco 2, considerado moderado.

Procedimentos-padrão de laboratório:

São os mesmos do NB-1 e pode-se acrescentar:

• Os analistas devem passar por avaliação médica e receberem imunizações relacionadas com os agentes manipulados ou presentes no laboratório;
• Recomendável o desenvolvimento do Manual de biossegurança;
• Treinamento anual da equipe sobre os potenciais riscos;
• Os equipamentos deverão ser descontaminados frequentemente;
• As portas do laboratório deverão permanecer fechadas e trancadas ao final das atividades;
• O símbolo internacional indicando risco biológico (Figura 1) deve ser identificado na porta do laboratório em que há manipulação dos agentes biológicos da classe de risco 2.

Figura 1: Símbolo do risco biológico (Fonte: Pixabay)

• Os EPIs devem ser higienizados e, quando aplicáveis, descartados em locais destinados para essa finalidade;
• Os procedimentos devem prezar pela prevenção da formação de aerossóis ou gotículas;
• Os equipamentos devem ser: calibrados, certificados e ter um sistema de manutenção periódico;
• Os filtros HEPA – High Efficiency Particulated Air da área de biocontenção devem ser testados e certificados anualmente.

Os resíduos e materiais devem ser esterilizados (em autoclave, 121°C por 20 minutos) previamente do descarte ou reutilização.

Equipamentos de contenção

• EPI adequados da mesma maneira que o NB-1;
• Luvas de látex descartáveis e de uso restrito ao laboratório;
• Utilização de CBS, de classe I ou II, obrigatórias quando o analista manipular agentes patogênicos;
• Autoclave para possibilitar a descontaminação dos materiais e resíduos gerados, antes de reutilizados ou descartados.

• Nível de Biossegurança 3 (NB – 3)

Recomendado para trabalho com agentes biológicos da classe de risco 3, considerados graves por seus agentes biológicos causarem doenças letais. Nesse nível, é primordial possuir equipamentos de segurança e instalações mais eficazes comparados com os dois anteriores.

Procedimentos-padrão de laboratório:

• Registro obrigatório do laboratório junto a autoridades sanitárias nacionais;
• As mesmas exigências definidas para o NB-2, com o uso obrigatório de CSB classe II ou III, para todas as manipulações que envolvem agentes e materiais biológicos;
• Os analistas do laboratório devem ter ciência do potencial risco do ambiente;
• Deve-se ter o número mínimo necessário de profissionais para as atividades;
• Equipe deve ser treinada em biossegurança, com Manual contemplando os Procedimentos Operacionais Padrões – POP acessíveis para todos;
• Proibido o uso de EPI na área externa ao laboratório, com atenção aos procedimentos adequados para esterilização e descarte;
• Os analistas devem realizar avaliação médica periódica e receber imunização aos agentes manuseados ou presentes no laboratório;
• Todos os resíduos devem ser obrigatoriamente esterilizados antes do descarte;
• Os materiais devem ser esterilizados antes da reutilização;
• Os filtros HEPA, pré-filtros das CSB e dos sistemas de ar retirados devem ser armazenados em recipientes hermeticamente fechados para serem esterilizados;
• Acidentes ou incidentes devem ser relatados e medidas de mitigação e remediação cabíveis devem ser tomadas;
• O analista responsável deve assegurar a documentação de todos POP do NB-3, além da verificação dos equipamentos e instalações com frequência anual, incluindo a calibração e eficiência, conforme especificações do fabricante ou BPL.

Equipamentos de contenção

• Todos os procedimentos com culturas ou outro material infeccioso, devem ser realizados dentro de Cabines de Segurança Biológica (CSB) classe II, B2 ou III;
• Equipamentos de Proteção Individual (EPI) e outros dispositivos de contenção física, se necessários;
• Autoclave, de dupla porta e fluxo único;
• Roupas de proteção adequadas: máscaras, touca, luvas, propés, óculos de proteção
• Luvas devem ser trocadas e descartadas com o lixo laboratorial;
• Aplicação do POP de lavagem de mãos após qualquer procedimento.

• Nível de Biossegurança 4 (NB-4)

Recomendado para trabalho com agentes biológicos da classe de risco 4, considerado alto risco de transmissão individual por via respiratória e/ou desconhecida.

Procedimentos-padrão de laboratório:

• Intensificação dos programas estabelecidos para NB-3;
• Exigência obrigatória de CSB classe II b2, associadas com uso de roupas de proteção com pressão positiva, ventiladas por sistema de suporte à vida:
• Ou CSB classe III:
• Controle de entrada e saída de profissionais;
• Conhecimento do risco pela equipe;
• Treinamento;
• Controle periódico do estado de saúde dos analistas;
• Plano de contingência e emergência para casos de acidentes ou incidentes;
• Os filtros HEPA e pré-filtros das CSB e dos sistemas de ar devem ser removidos e acondicionados em recipientes hermeticamente fechados para descontaminação e destruição:
• Os materiais oriundos da área de biocontenção devem ser esterilizados e os resíduos após a esterilização, devem receber o tratamento previsto nas normas vigentes.

Equipamentos de contenção

Laboratório de contenção máxima para manipulações de materiais biológicos da classe de risco 4, pode ser:

• Manipulações conduzidas em CSB de classe III ou manipulações conduzidas em CSB de classe II, B2, neste caso, usado em associação à roupa de proteção pessoal, peça única ventilada, de pressão positiva, possuindo um sistema de suporte à vida, protegido por filtros HEPA.

Mapa de Riscos

O mapa de riscos está anexo à Portaria n° 25, de 29 de dezembro de 1994 (NR 5*) e é de extrema importância, pois estabelece o diagnóstico da segurança do laboratório e a prevenção dos riscos identificados sobre o layout, a partir da análise preliminar do risco. Os riscos ocupacionais são classificados conforme a sua natureza e possuem a padronização das cores correspondentes. Além disso, a intensidade do risco deve ser proporcional ao tamanho do círculo (conforme a Figura 2). O mapa deverá ser elaborado pela CIPA – Comissão Interna de Prevenção de Acidentes juntamente com outros colaboradores e deverá ser alocado em local visível a todos trabalhadores.

*A NR 5 foi atualizada em 2016 e não mais estabelece a metodologia para a elaboração do mapa de riscos, ficando aberta a possibilidade de utilização de metodologias mais avançadas. Nada impede, porém, que se adote a metodologia estabelecida em redação anterior da NR 5.

Figura 2: Mapa de riscos para Laboratório de Microbiologia (Fonte: adaptado de BORGES; CAMPOS; RODRIGUES, 2017).

BPL para proteção do alimento que será analisado

Para a análise microbiológica do alimento, é de extrema importância o emprego das BPL pelo analista, para proteger não somente a sua saúde, mas também a integridade da amostra, e para evitar a ocorrência de resultados falsos positivos ou negativos. A seguir, são apresentadas algumas práticas imprescindíveis e as etapas relacionadas:

– Coleta da amostragem: o analista deve estar com EPI (touca, avental descartável, óculos, toda paramentação de acordo com NR), com as mãos limpas e, dependendo do caso, é recomendável o uso de luvas descartáveis. O local e o utensílio para coletar a amostra deve ter sido esterilizado se for reutilizado (autoclavagem, 121°C, por 15 minutos, se for metal, por exemplo, o binômio de tempo e temperatura pode variar de acordo com o material) ou, se for descartável após o uso, deve ser estéril.

– Preparo da amostra: a homogeneização da amostra é imprescindível para a sua representatividade. Se a amostra do alimento estiver contida em uma embalagem, é essencial a assepsia antes da coleta (com álcool 70%).

– Pesagem da amostra: uso de EPI pelo analista, os instrumentos devem estar estéreis, assepsia ambiental realizada e equipamentos previamente verificados e calibrados.

– Meio de cultura: Antes de inocular a amostra, o meio deve ser esterilizado e, a metodologia, seguida corretamente: ao inocular a amostra, homogeneizar corretamente, para que ocorra a correta distribuição dos nutrientes. Não utilizar meios de cultura vencidos.

– Reagentes empregados: a água empregada para análise deve ser destilada e autoclavada para garantir a esterilidade e não interferir no resultado da análise. Controle da qualidade para não contaminar a amostra a ser analisada, especialmente no pré-tratamento da amostra, quando aplicável.

– Placas de petri devem ser estéreis e estar identificadas (com nome da amostra, data da análise e iniciais do analista), para que não ocorram dúvidas quando a contagem de UFC for realizada. Se apresentarem alguma avaria, como trincas, as placas devem ser descartadas.

– Homogeneização da amostra: quando tiver uma diluição, após a sua homogeneização, é imprescindível respeitar o tempo de espera antes da inoculação.

– Metodologia empregada: cada análise deve ter o seu respectivo POP elaborado, que deverá ser seguido, inclusive para limpeza dos equipamentos utilizados.

– Equipamentos utilizados: devem estar calibrados e verificados antes de realizar a análise.

– Ambiente de inoculação: deve estar esterilizado. Ao realizar a análise, é imprescindível verificar se o ambiente da cabine biológica está estéril, por meio de uma placa contendo apenas o meio e que deverá ser incubada na temperatura indicada no método. O correto é não crescer qualquer micro-organismo. Caso contrário, pode ser um indicativo de contaminação do ambiente.

– Ambiente de incubação: a temperatura da incubadora deve estar de acordo com a metodologia empregada e com o micro-organismo que será analisado. A temperatura para bolores e leveduras é diferente da temperatura para bactérias.  O analista deve realizar a verificação da temperatura da incubadora, e no momento da incubação, as placas devem ser organizadas para serem mantidas na temperatura e circulação de ar corretas. Evitar empilhar várias placas e jamais alterar a temperatura indicada no método.

– Contaminação cruzada: as BPL são imprescindíveis para prevenir a contaminação cruzada, que pode ocorrer em qualquer etapa da metodologia. Todos os cuidados previamente citados são imprescindíveis para a acurácia dos resultados das amostras dos alimentos.

– Descarte de resíduos: as amostras, após a análise, são armazenadas em sacos especiais e esterilizadas em autoclave (121°C por 20 minutos). Posteriormente, são encaminhadas ao destino do lixo orgânico da empresa ou instituição. As placas de petri e ponteiras da pipeta, após a análise, também são autoclavadas e destinadas ao lixo orgânico.

Referências:

ANDRADE, K.P.; ALENCAR, L.; BRAGANÇA, R. N.P. A importância do preparo da amostra para o sucesso da análise de alimentos. Higiene Alimentar, v. 22, n. 160,  2008. Disponível em neste link.  Acesso em: 08 fev. 2021.

BORGES, L.J.; CAMPOS, M.R.H.; RODRIGUES, C.A.P. Manual de Biossegurança e Boas Práticas do Laboratório de Controle Higiênico-Sanitário de Alimentos. Universidade Federal de Goiás, 2017. Disponível neste link. Acesso em: 09 fev. 2021.

BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº. 302, de 13 de outubro de 2005. Dispõe sobre Regulamento Técnico para funcionamento de Laboratórios Clínicos. Disponível em: <file:///C:/Users/Usuario/Downloads/RDC_2005-302.pdf> Acesso em: 02 fev. 2021.

BRASIL. Norma regulamentadora 5 – NR 5  Comissão Interna de Prevenção de Acidentes – CIPA. Disponível em <http://www.guiatrabalhista.com.br/legislacao/nr/nr5.htm> Acesso em: 10fev. 2021.

BRASIL. Ministério da Saúde. Resolução RDC n°4, de 18 de janeiro de 2012. Dispõe sobre os critérios para a realização de estudos de resíduos de agrotóxicos para fins de registro de agrotóxicos no Brasil. Disponível neste link. Acesso em: 02 fev. 2021.

BRASIL. Portaria SSST n.º 25, de 29 de dezembro de 1994. Norma regulamentadora 9 – NR 9. Programa de prevenção de riscos ambientais.

Diretrizes Gerais para o Trabalho em Contenção com Material Biológico, elaborado em 2010 pela Comissão de Biossegurança em Saúde (CBS) do Ministério da Saúde (MS, 2010).MS,  Brasília, v.3, 2010. Disponível neste link. Acesso em: 02 fev. 2021.

SALVATORI, R.U.; WOLF, G.A.K.; DRESCH, F.; STROHCHOEN, A.A.G. Laboratório de Microbiologia: normas gerais, instruções de trabalho e Procedimentos Operacionais Padrões. Univate, Lajeado, n.1, 2013. Disponível neste link. Acesso em: 10fev. 2021.

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