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Imagem Lumar Lucena A identificação microbiana é sempre um desafio, mesmo os microbiologistas mais experientes se deparam com morfologias que podem facilmente confundir em uma primeira visualização. Esse é o caso quando falamos em identificação de cocos gram-positivos, que estão entre os patógenos mais perigosos para a saúde humana de acordo com a OMS e muitas vezes podem apresentam morfologias semelhantes entre as diversas espécies. Apesar de a interpretação do crescimento em placa ser de grande valia e representar uma porcentagem grande na triagem sobre qual espécie estamos diante, precisamos nos certificar de fazer um trabalho seguro na identificação do patógeno. E nesse sentido recorremos a testes/provas bioquímicas de triagem e identificação para chegarmos na espécie que de fato é responsável pela patologia. Toda identificação se inicia com o bacterioscópico, a técnica de gram é o start que irá nos direcionar sobre qual ou quais testes seguiremos na rotina para a identificação microbiana. Através da bacterioscopia avaliaremos a morfologia dos cocos e se podemos estar diante de cocos gram-positivos ou gram-negativos, isolados, aos pares, agrupados, arranjados em cadeias, fileiras, cocobacilo etc. Após a avaliação morfológica, seguimos com diversas provas bioquímicas para chegar na espécie correta e neste artigo falaremos quais são os testes geralmente utilizados na rotina para a identificação dos cocos gram-positivos. Identificação de Cocos Gram-positivos: Staphylococcus sppOs estafilococos representam um gênero de bactérias gram-positivas e estão entre os patógenos mais comuns nos seres humanos. São microrganismos de formato esférico e, geralmente, se arranjam em grupos com aspecto de cachos de uva. Após coloração de técnica de gram, adquirem cor púrpura ou arroxeada quando visualizados sob microscopia (bacterioscopia). Essa retenção do corante de gram se dá por uma característica de membrana simples e parede celular de peptideoglicano grossa, constituída de mureína, ácido teicóico e polissacarídeos. São microrganismos anaeróbios-facultativos, isto é, vivem sob anaerobiose porém conseguem crescer também sob tensões baixas de oxigênio através da fermentação. Mas são bactérias que crescem melhor em aerobiose e em meios ricos. Dentre as principais espécies, estão:
Teste da CatalaseÉ uma prova bioquímica utilizada para diferenciar Staphylococcus spp de Streptococcus spp, porém esse teste diferencia família e não gênero. Staphylococcus são produtores da catalase, uma enzima que converte o H2O2 em O2 + H20. Quando estamos diante de uma espécie e não temos certeza se estão arranjados em grupos/cachos ou em fileiras, montamos uma lâmina com gotas de peróxido de hidrogênio e misturamos uma pequena porção da colônia em cada uma das gotas. Se neste momento houver efervescência, significa que estamos diante de um Staphylococcus spp, caso não haja produção de gás podemos estar diante de um Streptococcus spp.
Staphylococcusspp são catalase positivos. Porém há algumas espécies de Staphylococcus catalase negativos!! A Renata Correa Gomes fez uma síntese super bacana e didática sobre o teste da catalase, vale muito a pena conferir!! Teste da CoagulaseProva bioquímica utilizada quando estamos diante de um Staphylococcus spp e queremos saber a sua espécie, por exemplo se trata-se de Staphylococcus aureus ou SCN (Staphylococcus coagulase negativa) Algumas espécies de Staphylococcus spp, como por exemplo o Staphylococcus aureus, são produtoras de uma enzima chamada coagulase. Essa enzima converte o fibrinogênio em fibrina, formando coágulo que atuará como proteção da bactéria contra os fagócitos e a isolando de outros sistemas de defesa do hospedeiro. (Tortora et al., 2012.) A realização desse teste se dá misturando uma pequena porção da colônia sobre uma gota de plasma de coelho e após determinado tempo é possível observar a formação ou não de pequenos coágulos. Caso esse processo seja positivo, estamos diante de um Staphylococcus aureus (espécie produtora de coagulase). Nas situações em que o teste da coagulase seja negativo, podemos possivelmente estar na presença de um S. epidermidis ou S. saprophyticus. Staphy testProva bioquímica utilizada para diferenciar S. aureus de outras espécies de Staphylococcus spp, seria como uma variação do teste da coagulase. Esse teste se baseia na capacidade do Staphylococcus aureus em aglutinar hemácias de carneiro previamente sensibilizadas com hemolisina e fibrinogênio. Ao homogeneizar uma pequena porção da colônia nesse componente de hemácias + fibrinogênio + hemolisina, se houver aglutinação trata-se positivamente de Staphylococcus aureus. Teste da DNaseÉ um teste para avaliar a capacidade de um microrganismo ser produtor de uma enzima chamada desoxirribonuclease, que tem por finalidade de ação despolimerizar/degradar o ácido desoxirribonucleico (DNA) presente no meio de cultura. É útil para diferenciar diversas espécies bacterianas, como:
Técnica do testeNeste teste deve-se utilizar um meio de cultura específico, o Ágar DNase, onde a triptona será a fonte de aminoácidos para promover o crescimento bacteriano, o NaCl será responsável pelo equilíbrio osmótico do meio e o DNA é o substrato para determinar a ação enzimática. Inicia-se fazendo um inoculo no meio de cultura e seguindo para incubação a 35°C por um período de 18h a 24h. Posteriormente à incubação, adiciona-se HCl 1N cobrindo as colônias e aguardamos aproximadamente 30 segundos para avaliar a atividade enzimática. O ácido clorídrico (HCl) promoverá a precipitação do DNA degradado, fazendo com que o meio de cultura fique opaco. As espécies de bactérias produtoras da enzima dnase, e que obviamente degradaram o DNA presente no ágar, apresentarão ao seu redor um alo transparente. Como nesta imagem que mostra o resultado do teste da DNase, feita pela Erika Lopes Silva e compartilhada em uma postagem no seu perfil do LinkedIn. Conteúdo este que me serviu de fonte para adapatar algumas informações e compor esta parte do artigo. Erika, muito obrigado pelo conteúdo publicado! Comercialmente, além do Ágar DNase, temos à disposição o Ágar com Azul de Toluidina, onde a ação enzimática da DNase será revelada pela quebra do complexo DNA-Corante formando uma cor metacromática identificada por zonas de coloração róseas a vermelhas ao redor das colônias. Creditos pela imagem à Plastlabor. Teste de Sensibilização à NovobiocinaProva que nos permite diferenciar cepas de Staphylococcus saprophyticus de outros estafilococos não produtores de coagulase. O Staphylococcus saprophyticus tem resistência conferida à Novobiocina. A técnica deste teste baseia-se em semear em Ágar Muller-Hinton com disco de novobiocina 5mg a cepa que desejamos identificar. Após incubação verificar a formação de halo de inibição para Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, como na imagem abaixo: Identificação de Cocos Gram-positivos: Streptococcus sppSão microrganismos também de morfologia esférica, gram-positivos, que se agrupam em pares ou cadeias curtas. São bactérias que, no geral, não são patogênicas aos seres humanos, porém algumas espécies podem sim causar patologias graves. Os estreptococos não são produtores da enzima catalase, portanto uma característica de diferenciação importante dos estafilococos. Apesar de que, conforme dito mais acima, existem espécies de Staphylococcus que não produzem essa enzima e são negativos para o teste da catalase. Dentre algumas espécies de interesse clínico, estão:
Teste da OptoquinaProva de identificação utilizada para diferenciação entre estreptococos alfa-hemolíticos e pneumococos (Streptococcus pneumoniae). Os pneumococos são normalmente sensíveis a optoquina, enquanto os estreptococos (em especial os estreptococos alfa-hemolíticos) não o são. Técnica do teste Partindo do caldo BHI ou TSB recém turvado, proceder com a semeadura em Ágar Sangue com disco de optoquina 5mg e seguir com incubação a 35°C por 24 horas. Após incubação, verificar a formação de halo de inibição de 14mm ou mais para disco de optoquina de 6mm. Teste da Bile EsculinaTem por finalidade diferenciar Enterococcus spp de Streptococcus do grupo D, porém é um teste com possibilidade de uso na diferenciação de Enterococcus spp e Streptococcus bovis de Streptococcus spp. A presença de bile no meio inibe o crescimento de microrganismos Gram-negativos. A hidrólise da esculina em esculetina reage com o citrato férrico presente no meio formando um complexo negro, o que garante a diferenciação entre os 2 gêneros (enterococos de estreptococos). Ágar Bile Azida EsculinaÉ um meio de cultura utilizado utilizado para isolamento seletivo de estreptococos do grupo D (Streptococcus bovis), e também para diferenciação de Enterococcus spp e Streptococcus bovis (Streptococcus do grupo D) de Streptococcus spp. em amostras farmacêuticas e de alimentos. É um meio que promove uma ação bioquímica muito parecida com o teste da bile esculine mencionado mais acima, porém não é recomendado para uso diagnóstico em seres humanos. O princípio de ação é semelhante ao teste da bile esculina: A esculina do meio de cultura é degradada em esculetina que reagirá com sais de ferro presente no ágar. Essa interação promoverá uma reação bioquímica formando um complexo de cor enegrecida e escurecendo o meio de cultura. Para entender melhor como é esta reação bioquímica no meio de cultura, observem a imagem ao lado. Créditos à Plastlabor pela imagem: Enterococcus faecalis ATCC 29212. Apesar de o ágar bile azida esculina não ser utilizado na rotina clínica, quis trazer para conhecimento de que existem em outros segmentos da Microbiologia, como na área de alimentos e farmacêutica, testes ou provas bioquímicas semelhantes ao teste da bile esculina. O conteúdo de hoje, que faz parte do meu treinamento de Técnicas Laboratoriais em Microbiologia Clínica, pode ser útil para quem ainda não está familiarizado com os testes de triagem utilizados na bancada quando estamos diante de cocos gram positivos. Podem haver variações dos testes utilizados dependendo do laboratório de atuação, isto é, dependendo do protocolo adotado pela organização a execução deste ou daquele teste pode sofrer alguma variação. Em um artigo próximo falarei sobre os testes padrão para identificação das enterobactérias, não percam. Espero que tenham gostado, qualquer dúvida podem me procurar que terei o maior prazer em responde-los. Um abraço e até a próxima! Por: Bruno Brunetti Redes Sociais Referências para este artigo
Qual teste diferenciar Staphylococcus de Streptococcus?Rotineiramente, o teste da catalase é utilizado para diferenciar os estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase negativa).
Quais os principais testes para identificar os Staphylococcus?Os utilizados para identificar Staphylococcus sp. segundo a Anvisa são a coloração de gram, o teste de catalase,o teste de bacitracina, o teste da coagulase e o teste com novobiocina.
Qual o primeiro teste bioquímico empregado para diferenciação dos gêneros Staphylococcus e Streptococcus *?A prova da catalase é comumente utilizada para a diferenciação de estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase negativa).
Como se dá a diferenciação laboratorial entre as espécies de Staphylococcus?A identificação começa com a inoculação primária na placa de ágar 5% de sangue de carneiro. Em ágar sangue as colônias de estafilococos apresentam-se com coloração branca ou amarelada, opacas, cremosas e convexas, sendo que algumas cepas bacterianas produzem beta-hemólise (Figura 1).
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Qual teste é utilizado para diferenciação de Staphylococcus e Streptococcus?
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