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Segundo a Anvisa, as bactérias Gram-positivas, especialmente os cocos, estão entre os microrganismos mais frequentemente isolados de amostras biológicas humanas em laboratórios de microbiologia. Neste artigo, abordaremos principalmente as características e identificação do Staphylococcus aureus, o mais importante microrganismo dentre os estafilococos, sendo responsável pelo segundo maior número de infecções em seres humanos. Os Staphylococcus aureus são cocos gram positivos não esporulados, imóveis, anaeróbios facultativos, produtores de catalase, e dispostos em grupos ou “cachos de uvas”. Pertencem à família Micrococcaceae, e é uma das 37 espécies do gênero Staphylococcus. As colônias de S. aureus (aureus, do latim, “dourado”) podem se apresentar em colocação amarelada e formação de halo em ágar sangue. São comumente encontrados na nasofaringe de aproximadamente 60% da população em geral, pele e raramente na vagina; e de todas as espécies do gênero Staphylococcus, o S. aureus Identificação vCrescimento e aspecto da colônia e coloração de gram O início de toda identificação bacteriana deve ser pelo aspecto da colônia e microscopia. Como dito anteriormente, o S. aureus geralmente apresenta coloração dourada. Quando semeado em ágar sangue, pode haver ou não formação de beta hemólise no halo ao redor da colônia. Ressalta-se ainda o fato de que não há crescimento no meio de cultura MacConkey, por ser um coco gram-positivo.
Com a coloração de gram, podemos observar cocos gram positivos (coloração roxa/azulada), dispostos em grupos ou como descrito didaticamente, em forma de “cachos de uvas”.
vProva da catalase A prova da catalase é comumente utilizada para a diferenciação de estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase negativa). Segundo o manual da Anvisa, há relatos de Staphylococcus aureus catalase negativa relacionados a processos infecciosos, embora raros, descritos em vários países, inclusive no Brasil. Embora não seja um fator essencial para a sobrevivência desta bactéria, a catalase constitui um mecanismo de defesa para o S. aureus contra células fagocitárias. Este teste consiste em colocar uma amostra da bactéria em contato com o peróxido de hidrogênio, e pesquisar a formação de bolhas de oxigênio. Obs.: é importante que quando a colônia for retirada do meio ágar sangue, não haja contato da alça bacteriológica com o meio, evitando um falso positivo.
A reação que ocorre então é a seguinte:
vProva da coagulase O S. aureus é a única espécie de Staphylococcus que produz uma enzima extracelular chamada de coagulase. Sendo essa produção mais comum pelos S. aureus, dentre os estafilococos, temos então um bom critério para a identificação de uma amostra como pertencente à espécie. O teste verifica se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada, que, reagindo com um fator plasmático, forma um complexo que atua no fibrinogênio do plasma formando a fibrina.
Pode ser realizado em tubo (incubar por 4 h a 35±2ºC e observar formação de coágulo), ou lâmina, observando a formação de grumos. Obs.: não recomenda-se que a colônia seja retirada de um ágar com grande concentração de sal como, por exemplo, o ágar manitol.
Há ainda os testes de coagulase comerciais, que testam a presença da proteína A (que tem a habilidade de se ligar à porção FC de IgG, impedindo, portanto que ela sirva de fator de opsonização na fagocitose) e do fator de coagulação (clamping factor). Um destes kits comumente utilizado é o Staphy-Test®, da Probac. O S. aureus aglutina hemácias de carneiro previamente sensibilizadas com hemolisina e fibrinogênio. As reações da hemolisina e do fibrinogênio, respectivamente, com a proteína A e o “clumping factor” do S. aureus, determinam aglutinação imediata das hemácias sensibilizadas. vFermentação do Manitol O Ágar Manitol é um meio de cultura com indicativo vermelho de fenol, seletivo para estafilococos patogênicos e para a diferenciação de S. aureus de outros Staphylococcus coagulase negativa. Este teste verifica se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o manitol contendo 7,5% de cloreto de sódio. O meio de cultura tem coloração rosa, e a formação de halo amarelo ao redor das colônias indica então o S. aureus.
Entretanto, é válido ressaltar que outras espécies de estafilococos também podem produzir ácido a partir do manitol, e sendo assim, é necessário que esta prova seja complementada com o teste da coagulase. vDNase Este teste verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o ácido nucléico (DNA). Para isso, é usado o meio de cultura, em tubo ou placa, com azul de toluidina O. A formação de halo cor-de-rosa ao redor do inoculo, indica S. aureus. Embora seja usado na identificação do S. aureus, este teste é usado também para outros microrganismos e, portanto, não deve ser critério de diagnóstico sem provas complementares e análise da colônia e microscopia. vTeste de resistência à novobiocina Este é um teste bastante aplicável à urocultura, para a diferenciação de S. aureus e S. saprophyticus (causador de infecções frequentes no trato urinário, principalmente em mulheres). O teste é realizado como um antibiograma qualquer, em placa de Mueller-Hinton. O halo ≤ 16 mm (resistente) identifica S. saprophyticus, e o halo ≥ ≤ 16 mm (sensível), indica S. aureus. Outras provas para identificação também pode ser aplicadas para a identificação de Staphylococcus em geral, como a resistência a bacitracina e furazolidona, que diferencial este gênero dos Micrococcus; e ainda há a automação como o VITEK® MS da Biomeriux, ou o Phoenix® da BD, empregado na identificação bacteriana em laboratórios com grande demanda de exames. Resistência bacteriana A primeira vez que um antibiótico foi usado, clinicamente, foi contra uma infecção por Staphylococcus aureus, por Alexander Fleming. A penicilina funcionou bem contra infecções estafilocócicas até os anos 60, mas logo a resistência de algumas cepas começou a ser descrita. A resistência está relacionada à produção de uma enzima predominantemente extracelular denominada penicilinase, sintetizada pelos estafilococos após exposição aos beta-lactâmicos, que hidrolisa o anel beta-lactâmico e inativa o antibiótico. vResistência à meticilina Pelo surgimento da resistência à penicilina, foi preciso que outro antibiótico fosse capaz de tratar as infecções estafilococócicas. Assim, foi criado o beta-lactâmico sintético meticilina, que era resistente à ação das beta-lactamases. Este antibiótico foi eficaz até os anos 70, quando novamente, cepas resistentes surgiram. São os chamados Staplhylococcus aureus resistentes à oxacilina denominado de ORSA (oxacillin resistant S. aureus) ou MRSA (methicillin resistant S. aureus). A oxacilina é a droga representante deste grupo por ser a mais resistente à degradação e a mais sensível para detecção de heterorresistência. Entretanto, se S. aureus for resistente à ela, é resistente à também à Meticilina e à todos os beta-lactâmicos. O principal mecanismo que confere tal resistência está relacionado à alteração do sítio de ação dos beta-lactâmicos, ou seja, alteração das proteínas ligadoras de penicilinas denominadas PBPs. As PBPs são enzimas importantes na síntese da parede bacteriana. A presença de enzima alterada, denominada PBP2a ou PBP2’, leva a baixa afinidade da oxacilina pelo local de ligação na parede celular da bactéria com consequente inatividade. Estas alterações são codificadas pelo gene mecA, que faz parte de um elemento genético móvel encontrado em todos os isolados com este tipo de resistência, denominado cassete estafilocócico do cromossomo mec (SCCmec). Este elemento genômico é composto pelo complexo do gene mec, que codifica resistência à oxacilina, e pelo complexo do gene ccr, que codifica recombinases responsáveis pela sua mobilidade e podem conter outros genes de resistência para outros agentes antimicrobianos. Na comunidade, a maioria das infecções por ORSA são infecções de pele, e são sensíveis a outros antibióticos. Em ambiente hospitalar, o ORSA causa infecções da corrente sanguínea com risco de vida, pneumonia e infecções de sítio cirúrgico, e é multirresistente. vResistência à glicopeptídeos Já puderam observar o quão grave é o ORSA, certo? E a situação conseguiu piorar. Uma das únicas opções para o tratamento do ORSA (MRSA) é a vancomicina. Ou melhor, era! Em 2002 foi descrita a transferência da resistência à este antibiótico de bactérias como estreptococos resistentes à vancomicina (VRE) para estafilococos. No Brasil, o primeiro caso de VRSA (S. aureus resistente à vancomicina) foi descrito em abril de 2014. Os VRSA apresentam resistência completa aos glicopeptídeos, e o seu mecanismo de resistência está relacionado à aquisição por conjugação, pelo S. aureus, de um plasmídeo ou transposon carreador do gene vanA proveniente do Enterococcus faecalis, resistente aos glicopeptídeos. Além do VRSA, há outro fenótipo, o VISA, que está relacionado com o espessamento da parede bacteriana, impossibilitando a ação do glicopeptídeo devido à captura de suas moléculas que ficam retidas na parede bacteriana e comprometem a eficácia terapêutica deste agente. Semelhante à oxacilina, apresenta estágio inicial de resistência, denominado heterorresistência, com presença de sub-populações resistentes para este antimicrobiano.
Obviamente que essa resistência assusta, mas ainda assim o VRSA e VISA são eventos raros. Não obstante, é preciso que a ciência prossiga cada vez mais rápido, antes que seja tarde. Sobre as pesquisas, leiam o artigo sobre a Teixobactina, uma nova molécula descoberta que poderá originar nova classe de antibióticos e tratar as infecções por S. aureus multirresistentes. Encontrou algum erro? Conte-nos pelo e-mail Fontes: Mundim, G. J., et al. Avaliação da presença de Staphylococcus aureusnos leitos do Centro de Terapia Intensiva do Hospital Escola da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro, em relação à posição no colchão antes e após a limpeza. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.36 no.6 Uberaba Nov./Dec. 2003. Como podemos diferenciar as espécies de Staphylococcus?Assim, as espécies que possuem a enzima são denominadas coagulase positiva, sendo o Staphylococcus aureus a única espécie desse grupo, e as espécies que não possuem são chamadas de estafilococos coagulase negativa, cujas principais espécies são Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus.
Como se dá a diferenciação laboratorial entre as espécies de Staphylococcus foque na identificação de S. aureus?A diferenciação entre os estreptococos e os estafilococos se dá, seguramente, pela prova da catalase. Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre este esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar a formação de bolhas.
Como se dá a diferenciação laboratorial entre os gêneros Staphylococcus e Streptococcus?Para a diferenciação básica e confirmatória entre os gêneros Staphylococcus e Streptococcus, utiliza-se a prova da catalase. A catalase é uma enzima produzida pelos Staphylococcus e não produzida pelos Streptococcus.
O que diferencia os Staphylococcus aureus das outras espécies e a produção de?O Staphylococcus aureus produz uma enzima chamada coagulase. Outras espécies de estafilococos não a produzem e, assim, são chamadas de estafilococos coagulase-negativos. Essas bactérias geralmente residem na pele de todas as pessoas saudáveis.
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Como se dá a diferenciação laboratorial entre as espécies de Staphylococcus?
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